Written by Kantima Sitlaothavorn

 

           Total Kjeldahl method คือเทคนิควิเคราะห์หาปริมาณโปรตีน (ไนโตรเจน) ทั้งหมดที่มีอยู่ในตัวอย่าง วิธีนี้ถูกพัฒนาโดย Dane Johan Kjeldahl เป็นชาวเดนมาร์ก ในราวปี ค.ศ. 1800 ซึ่งเป็นวิธีที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย ได้รับการยอมรับว่ามีความแม่นยำ โดยหลักการการทำงานคือ การย่อยสลายโปรตีน ซึ่งประกอบด้วยกรดอะมิโน (amino acid) ที่มีไนโตรเจนเป็นส่วนประกอบใน amino group การย่อยโปรตีนจะปลดปล่อยไนโตรเจนออกมา และถูกเปลี่ยนสภาพกลายเป็นไอ คือแอมโมเนีย

การวิเคราะห์หาโปรตีนด้วยวิธี Kjeldahl ประกอบด้วย 4 ขั้นตอนหลักคือ          

  1. การย่อยตัวอย่าง (digestion) ด้วยกรด H2SO4 เข้มข้น ภายใต้สภาวะอุณหภูมิสูง ที่มีการเติม K2SO4 เพื่อใช้เพิ่มจุดเดือด และ สารเร่งปฏิกิริยา เช่น CuSO4, Se, HgSO4, HgO หรือ FeSO4 ไนโตรเจนในตัวอย่างจะถูกเปลี่ยนเป็นแอมโมเนียมซัลเฟต (NH4)2SO4
  2. การกลั่นแอมโมเนีย (distillation) โดยใช้ NaOH มาทำปฏิกิริยากับเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตที่ได้จากการย่อยตัวอย่างแล้ว จะได้เป็นแก๊สแอมโมเนีย ซึ่งจับแก๊สนี้ด้วยสารละลายกรดบอริก
  3. การไตเตรตเพื่อหาปริมาณไนโตรเจน (titration)  เป็นการนำสารละลายกรดบอริก ซึ่งจับแก๊สแอมโมเนียไว้ มาไตเตรตกับสารละลายมาตรฐาน H2SO4 
  4. ปริมาณไนโตรเจนที่หาได้จะต้องนำมาคำนวณต่อด้วยการคูณกับค่าคงที่เพื่อให้ได้ปริมาณโปรตีนทั้งหมด

    ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้น

          จะเห็นว่าวิธี Kjeldahl ยังมีข้อจำกัดอยู่มาก เช่น ระยะเวลาการทดสอบที่ค่อนข้างยาวนาน ผู้วิเคราะห์ต้องมีทักษะความชำนาญ ต้องใช้สารเคมีที่มีกรดและด่างเข้มข้นหลายชนิดและปริมาณที่มาก ดังนั้นเทคนิค Dumas combustion จึงได้รับความสนใจและเป็นที่นิยมมากขึ้น เนื่องจากเป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพสูง ให้ผลที่ถูกต้องแม่นยำ และยังใช้ระยะเวลาในการทดสอบและการใช้สารเคมีที่น้อยกว่าเทคนิค Kjeldahl ที่สำคัญสามารถนำไปประยุกต์ใช้ได้กับงานหลายประเภท เช่น งานทางด้านอาหาร สิ่งแวดล้อม อุตสาหกรรม ปิโตรเคมี และยาได้อีกด้วย

          สำหรับเทคนิค Dumas combustion ถูกคิดค้นโดย Jean Baptiste Andre Dumas ราว ค.ศ. 1800-1884 โดยนักเคมีชาวฝรั่งเศส เป็นเทคนิคที่ใช้วิเคราะห์ปริมาณโปรตีน หลักการทำงานคือ ตัวอย่างจะถูกชั่งในปริมาณที่เหมาะสมลงในภาชนะ เช่น Tin capsule จากนั้นนำตัวอย่างไปเผาในเตาเผา (combustion tube) ที่มีอุณหภูมิไม่น้อยกว่า 850 oC ภายใต้บรรยากาศออกซิเจนที่มีความบริสุทธิ์ ไอสารที่ได้จากการเผาไหม้ ซึ่งส่วนใหญ่จะเป็นโมเลกุลของไนโตรเจน ไนโตรเจนออกไซด์ น้ำ คาร์บอนไดออกไซด์ และสารอื่นๆ เช่น สารประกอบซัลเฟอร์ ฮาโลเจน แก๊สตัวพาจะพาสารทั้งหมดเข้าไปใน Reduction tube โดยมีโลหะ เช่น ทองแดง หรือ แพลทินัม ซึ่งจะถูกรีดิวซ์ให้เป็นแก๊สไนโตรเจน ส่วนสารประกอบอื่นจะถูกกำจัดด้วยตัวดูดซับที่มีความจำเพาะแตกต่างกันออกไปตามชนิดของสาร น้ำที่เกิดขึ้นจะถูกกำจัดโดยตัวดูดซับ เช่น Lead Chromate, Silver wool, Silica wool 

          ปฏิกิริยาที่เกิดขึ่นภายในระบบ

          เมื่อได้แก๊สไนโตรเจนแล้วจะถูกพาเข้าไปที่ตัวตรวจวัดชนิด Thermal Conductivity detector (TCD) แสดงผลเป็นค่าปริมาณไนโตเจนทั้งหมด สามารถนำมาหาค่าโปรตีนโดยการคูณกับ Factor ที่เหมาะสมซึ่งขึ้นกับความสัมพันธ์ของปริมาณโปรตีนและกรดอะมิโนที่แตกต่างกันในแต่ละตัวอย่าง

          FlashSmart ยี่ห้อThermo Scientific เป็นเครื่องวิเคราะห์ N/Protein ด้วยการดัดแปลงจากเทคนิค Dumas ที่มีประสิทธิภาพสูง สามารถวิเคราะห์ตัวอย่างแบบอัตโนมัติได้มากถึง 125 ตัวอย่าง โดยวิธีวิเคราะห์อ้างอิงตามมาตรฐาน AOAC, ASTM, EN, ISO และ ใช้เวลาวิเคราะห์เพียงไม่กี่นาทีเท่านั้น

https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/brochures/FL-42237-OEA-FlashSmart-Official-Methods-FL42237-EN.pdf

 

สามารถติดตามข้อมูลเพิ่มเติมได้ใน https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11206100

 

 

 

Category: