KASP genotyping on Agricultural work

                                KASP™ (Kompettitive Allele Specific PCR) เป็นเทคโนโลยี genotyping ที่เป็นลิขสิทธิ์เฉพาะของ LGC, Biosearch Technologies (สหราชอาณาจักร) เป็นเทคนิคใหม่ที่ถูกพัฒนาขึ้นเพื่อตรวจหาการเปลี่ยนแปลงของสารพันธุกรรม (genetic polymorphism) ที่เกิดขึ้นในระดับของ DNA รูปแบบของ single/point mutation หรือที่นิยมเรียกกันว่า สนิปส์ SNPs (single-nucleotide polymorphism) และ InDel (Insertion, Deletion) โดยใช้หลักการ fluorescence based genotyping assay ซึ่งมีความแม่นยำ ถูกต้อง รวดเร็ว และมีระบบรองรับการตรวจกับจำนวนตัวอย่างที่มีปริมาณมาก (High throughput) และมีราคาต่อตัวอย่างไม่สูงมากเมื่อเทียบกับเทคนิคอื่นที่ใช้ในการตรวจหา SNP genotyping ความพิเศษของเทคโนโลยี KASP อยู่ที่ การออกแบบของ Primers ให้มีความจำเพาะต่อ SNPs, InDel หรือ ตำแหน่ง mutation และ Universal probe ที่ใช้ในการติดตามผล ขั้นตอนการทำประกอบด้วย 1. การสกัด DNA 2. การทำ PCR และ 3. การวิเคราะห์ผล KASP genotyping ด้วย endpoint Genotyping (Allelic discrimination/ Allele specific PCR) สามารถใช้เครื่องอ่านเพลท (Plate reader) รุ่น PHERAstar หรือใช้เครื่อง Real time PCR ที่มีโปรแกรมวิเคราะห์ endpoint genotyping เช่น LightCycler 480 (Roche), ABI7500, 7900 หรือ BIO-RAD CFX-96, CFX-384 เป็นต้น

ปัจจุบันการตรวจ KASP genotyping นั้นได้ถูกนำมาใช้ประโยชน์อย่างมากในงานวิจัยทางการเกษตร เช่น

• การคัดเลือกสายพันธุ์ โดยอาศัยเครื่องหมายทางพันธุกรรมระดับโมเลกุล (Molecular marker) ที่สามารถเห็นได้ชัดเจน เช่น การปรับปรุงพันธุ์ข้าว, ถั่วเหลือง, ปาล์มน้ำมัน, ข้าวโพด
• การตรวจสอบความบริสุทธิ์ของเมล็ดพันธุ์ลูกผสม (seed purity)
• การติดตามการกระจายตัวของยีนในประชากร (Geographic analysis of allele distributions)

หลักการทำงานของเทคนิค KASP genotypingประกอบด้วย

1. KASP Assay Mix
   • Allele-specific forward primers: ไพรเมอร์ forward ที่ปลาย 3’ จำเพาะต่อเบสที่ต้องการตรวจสอบ (SNPs) 2 เส้น โดยปลายด้าน 5’ จะมีลำดับเบสที่จำเพาะต่อฟลูออเรสเซนส์ HEX หรือ FAM
   • Reverse primer: ไพรเมอร์ common reverse 1 เส้น

      2. KASP Master mix

• KASP PCR Buffer
• KASP Taq Polymerase (Hot start Taq Polymerase)
• Reporter cassette (FRET cassette) คือ ลำดับเบสที่จำเพาะต่อปลาย 5’ ของไพรเมอร์ Forward ซึ่งมี ฟลูออเรสเซนส์ HEX (H) หรือ FAM (F) ติดอยู่ และมี Quencher (Q) สายเบสคู่สมจับไว้ทำให้ไม่สามารถเปล่งแสงได้ในรูปแบบของ double stand DNA
• dNTPs

        3. DNA template (sample)

KASP PCR amplification cycles

1. PCR รอบที่ 1
   • DNA template denatured แยกสาย ภายใต้ PCR Condition 94 °C
   • ขั้นตอน annealing : allele-specific forward primers เข้าจับกับเบสที่จำเพาะ และ common reverse primer จับกับสาย DNA template เพื่อสังเคราะะห์บริเวณที่ต้องการ (target region)

       2. PCR รอบที่ 2

• เมื่อ common reverse primer จับกับสาย DNA template ใน รอบที่ 2 จะเป็นการเติมเบสที่จำเพาะต่อปลายด้าน 5’ ของ allele-specific ที่มีลำดับเบสที่จำเพาะต่อฟลูออเรสเซนส์ HEX หรือ FAM

        3. PCR รอบที่ 3

• เมื่อ PCR amplicon มีส่วนที่จำเพาะต่อ FRET cassette (ฟลูออเรสเซนส์ HEX หรือ FAM) ที่ปลาย 5’ แล้วจากนั้น FRET cassette จะแยกสายกับ Quencher แล้วจับกับปลาย PCR amplicon เพื่อสังเคราะห์สาย DNA

      4. PCR รอบที่ 4 - รอบที่ 36

• เมื่อปฎิกริยา PCR เกิดขึ้นสมบูรณ์และเสร็จสิ้นในรอบที่ 36 ในปฎิกริยาจะประกอยด้วย PCR amplicon ที่มีเบสที่จำเพาะที่ต้องการตรวจอสบติดกับฟลูออเรสเซนส์ HEX หรือ FAM ที่ปลาย 5’ เรียบร้อยแล้ว
• อ่านค่าการเปล่งแสงฟลูออเรสเซนส์ HEX หรือ FAM ภายใต้ detector (Plate reader หรือ เครื่อง real-time PCR)

ตัวอย่างการคำนวน KASP Assay mix และ PCR cycles

การอ่านผล และวิเคราะห์ผล KASP

              การอ่านผล genotyping ในรูปแบบของจุดบนกราฟ (cluster plot) โดยอาศัย cluster analysis viewing software ของแต่ละเครื่อง real time PCR ที่ใช้ในการอ่านค่าฟลูออเรสเซนต์

• Homozygous สำหรับ allele X รายงานผลโดยฟลูออเรสเซนต์ FAM
• Homozygous สำหรับ allele Y รายงานผลโดยฟลูออเรสเซนต์ HEX
• Heterozygous ประกอบด้วย allele X และ Y
• No template control (NTC)

สรุปขั้นตอนการเตรียม KASP assay

ตัวอย่างการคัดเลือกสายพันธุ์ข้าว โดยอาศัยเครื่องหมายทางพันธุกรรมระดับโมเลกุล (molecular maker) ที่มีผลต่อการแสดงออก (functional marker) Yang และคณะ (2019) ได้ศึกษาว่ายีนที่ควบคุมหลากหลายลักษณะ เช่น การการสะสมแป้งในเมล็ด (ยีน GBSSI/Wx) ยีนความหอม (Badh2/fgr) ยีนต้านทานโรคไหม้ (Pik, Pi2) ด้วยเทคนิค KASP genotyping

การใช้เทคนิค KASP genotyping ในการติดตามเครื่องหมายทางพันธุกรรมในระดับโมเลกุลนี้ สามารถใช้ติดตามยีนเพื่อเป็นตัวคัดเลือกต้นข้าวในรุ่นลูกต่อไปได้  

ตารางแสดง functional marker ที่ใช้เทคนิค KASP genotyping ในการศึกษา

วิดีโอเทคนิค KASP genotyping

https://www.youtube.com/watch?v=Uq9HhmzOqUQ

https://www.youtube.com/watch?v=GJbM7UbE7ZI&t=209s

 สามารถตรวจสอบเครื่อง real time PCR ที่ใช้เทคนิค KASP ได้จาก website: https://www.biosearchtech.com/support/education/kasp-genotyping-reagents/running-kasp-genotyping-reactions#.XBoR6dU5o0N

ติดต่อเพื่อขอข้อมูลเพิ่มเติมได้ที่:

http://www.lifomics.com/contact.html

Line: @lifomics

http://www.lifomics.com/brochure/LGC/KASP_cluster_plot.pdf