เทคนิคแก๊สโครมาโทกราฟี-แมสสเปกโตรเมทรี

(Gas Chromatography-Mass Spectrometry; GC-MS)

วิธีการวิเคราะห์เพื่อหาชนิด (Qualitative) และปริมาณ (Quantitative) ของสารประกอบมีหลากหลายวิธีขึ้นกับคุณสมบัติของสารที่สนใจและตัวรบกวน 

เทคนิคแก๊สโครมาโทกราฟี

          เป็นเทคนิคหนึ่งที่ใช้ในการวิเคราะห์เพื่อหาชนิดและปริมาณของสารที่สนใจในตัวอย่างได้  โดยลักษณะของสารหรือตัวอย่างที่จะวิเคราะห์ด้วยเทคนิคนี้ได้ จะต้องมีคุณสมบัติในการระเหยกลายเป็นไอได้ง่าย เพราะเทคนิคนี้เป็นเทคนิคที่ใช้ในการ แยกสารผสมออกจากกันในสถานะแก๊ส โดยอาศัยความแตกต่างกันของคุณสมบัติในการละลายและความสามารถในการดูดซับของสารแต่ละชนิด บนเฟสเคลื่อนที่ (Mobile phase) และเฟสอยู่กับที่ (Stationary phase) 

ส่วนประกอบของเครื่องแก๊สโครมาโทกราฟ

1. แก๊สพา (Carrier gas) ทำหน้าที่ในการพาไอระเหยของสารตัวอย่างเข้าสู่คอลัมน์เพื่อให้เกิดการแยกและออกสู่ตัวตรวจวัดเพื่อบันทึกสัญญาณ ดังนั้นแก๊สพาจึงควรเป็นแก๊สเฉื่อย และควรเปิดไว้ตลอดเวลาที่เครื่องเปิดใช้งาน
2. ส่วนฉีดสาร (Injector) ทำหน้าที่ในการระเหยตัวอย่างให้กลายเป็นไอ เราจะฉีดตัวอย่างเข้าเครื่องตรงบริเวณนี้ การตั้งค่าความร้อนควรเหมาะสมกับตัวอย่างที่ต้องการวิเคราะห์ ไม่มากหรือไม่น้อยเกิดไป
3. คอลัมน์ (Column) และ ตู้อบคอลัมน์ (Column Oven)  ทำหน้าที่ในการแยกสาร เนื่่องจากตัวอย่างอยู่ในสถานะแก๊สดังนั้นคอลัมน์จึงต้องอยู่ในตู้ที่สามารถควบคุมความร้อนได้ป้องกันการควบแน่นของตัวอย่าง และการควบคุมอุณหภูมิที่เหมาะสมจะทำให้การแยกเกิดได้ดียิ่งขึ้นด้วย แต่คอลัมน์แต่ละชนิดทนความร้อนได้ไม่เท่ากัน ดังนั้นก่อนใช้งานควรศึกษาคุณสมบัติของคอลัมน์ที่มีอยู่ให้เข้าใจก่อนเริ่มงานป้องกันความเสียหายที่อาจจะเกิดขึ้นได้
4. ตัวตรวจวัด (Detector) ทำหน้าที่ในการตรวจวัดตัวอย่างที่ถูกแยกเรียบร้อยแล้ว ตัวตรวจวัดมีหลายชนิด  จึงควรศึกษาคุณสมบัติของตัวตรวจวัดให้เหมาะสมกับการวิเคราะห์สารที่สนใจก่อนเริ่มทำการวิเคราะห์
5. ซอฟแวร์และคอมพิวเตอร์สำหรับการประมวลผล ทำหน้าที่ในการบันทึกข้อมูลที่ได้จากการวิเคราะห์และประมวลผลการวิเคราะห์พร้อมทั้งรายงานผลการวิเคราะห์ได้ตามที่ต้องการ

หลักการทำงานของเทคนิคแก๊สโครมาโทกราฟี

          เมื่อสารผสมถูกนำเข้าสู่ส่วนฉีดสาร สารผสมจะเกิดการระเหยกลายเป็นไอและถูกพาเข้าสู่คอลัมน์ด้วยแก๊สพา ซึ่งทำหน้าที่เป็นเฟสเคลื่อนที่  สารผสมแต่ละชนิดจะถูกแยกออกจากกันโดยอาศัยคุณสมบัติในการละลายและความสามารถในการดูดซับในคอลัมน์ ซึ่งทำหน้าที่เป็นเฟสอยู่กับที่ หลังจากนั้นสารที่ถูกพาออกจากคอลัมน์ตามลำดับเวลาจะถูกตรวจวัดด้วยตัวตรวจวัดที่เหมาะสมเพื่อบันทึก เวลา (Retention Time) และขนาดสัญญาณ (Signal) ของสารแต่ละชนิดออกมาในรูปแบบ โครมาโทแกรม (Chromatogram)

           การแยกสารผสมด้วยเทคนิคแก๊สโครมาโทกราฟีจะเกิดขึ้นได้ดีโดยขึ้นกับพารามิเตอร์ที่ใช้ในการวิเคราะห์ ดังนี้

1. คุณสมบัติของคอลัมน์
   • พิจารณความสามารถในการละลายและดูดซับของสารที่สนใจบนคอลัมน์ โดยทั่วไปสารประกอบอินทรีย์จะพิจารณาจากความมีขั้ว (Polar) หรือ ไม่มีขั้ว (Non-polar) เช่น คอลัมน์ที่เคลือบด้วยโพลีเอทิลีนไกลคอล (Polyethylene glycol) เป็นคอลัมน์ที่มีขั้ว  จะสามารถแยกสารผสมกลุ่มแอลกอฮอล์ ซึ่งเป็นสารกลุ่มมีขั้วได้ดี  หรือ คอลัมน์ที่เคลือบด้วยเมทิลโพลีไซลอกเซนร้อยเปอร์เซ็นต์ (100% Methylpolysiloxane) เป็นคอลัมน์ที่ไม่มีขั้วจะสามารถแยกสารผสมโพลีไซคลิกอะโรมาติกไฮโดรคาร์บอน (Polycyclic aromatic hydrocarbons; PAHs) ได้ดี เป็นต้น
   • พิจารณาความกว้างภายใน (Internal Diameter) ความหนาของฟิล์ม (Film Thickness) และความยาวของคอลัมน์ (Column Length) โดยคอลัมน์ที่มีความกว้างภายในน้อย  ความหนาของฟิล์มมาก และความยาวของคอลัมน์มาก จะให้ผลการแยก (Resolution) ที่ดีกว่า 
2. พารามิเตอร์ของเครื่องมือที่ส่งผลต่อการแยกสาร
   • ขนาดตัวอย่าง (Sample size) หากขนาดของตัวอย่างมากเกินพอจะทำให้การล้นของตัวอย่างภายในคอลัมน์ (Overload) ทำให้ไม่สามารถแยกสารผสมออกจากกันได้
   • อุณหภูมิของตู้อบคอลัมน์ (Column Oven Temperature) โดยอาศัยหลักการอุณหภูมิต่ำสารออกช้าและอุณภูมิสูงสารออกเร็ว แต่ในบางครั้งหากใช้อุณหภูมิต่ำตลอดช่วงการวิเคราะห์ในกรณีที่มีสารผสมหลากหลายจะทำให้สารที่มีมวลโมเลกุลสูงถูกชะออกจากคอลัมน์แบบช้าๆ ทำให้ยากต่อการประมวลผล ดังนั้นการปรับอุณหภูมิของตู้อบคอลัมน์จึงส่งผลต่อการแยกสารผสมอย่างเห็นได้ชัด ดังตัวอย่าง

ตัวอย่างโครมาโทรแกรมของการวิเคราะห์สารผสมที่ใช้อุณหภูมิของตู้อบคอลัมน์ต่างกัน

       3. อัตราเร็วหรือความดันของแก๊สพา (Carrier gas flow rate or pressure) แก๊สพาทำหน้าที่ในการพาไอระเหยของสารผสมผ่านเข้าสู่คอลัมน์เพื่อให้เกิดการแยกซึ่งหากความเร็วหรือความดันที่ใช้สูงมากเกินพอก็จะทำให้การแยกเกิดขึ้นได้ไม่ดีเช่นเดียวกัน

การวิเคราะห์ผลด้วยเทคนิคแก๊สโครมาโทกราฟี

          การบันทึกผลของการวิเคราะห์ด้วยเทคนิคแก๊สโครมาโทกราฟีจะบันทึกในรูปแบบของ โครมาโทแกรม ซึ่งประกอบด้วยเวลาและขนาดสัญญาณ  เรียกขนาดสัญญาณที่พบ ณ เวลาช่วงหนึ่งๆว่า พีค (Peak)

สามารถวิเคราะห์ผลเชิงคุณภาพ (Qualitative analysis) และเชิงปริมาณ (Quantitative analysis) ได้ดังนี้

การวิเคราะห์เชิงคุณภาพ 

         โดยใช้เวลาที่สารถูกชะออกจากคอลัมน์สู่ตัวตรวจวัด (Retention Time, RT) เทียบกับเวลาของสารมาตรฐานเพื่อระบุชนิดของสาร

รูปแสดงโครมาโทแกรมเปรียบเทียบของสารมาตรฐานและสารผสมในตัวอย่าง

การวิเคราะห์เชิงปริมาณ 

          โดยขนาดสัญญาณ (พื้นที่ใต้พีค (Peak area) หรือ ความสูงของพีค (Peak height) ของสารมาตรฐานที่ความเข้มข้นต่างๆ มาสร้างความสัมพันธ์เชิงเส้นเพื่อหาความเข้มข้นของสารในตัวอย่าง

          จะเห็นได้ว่าการวิเคราะห์ด้วยเทคนิคแก๊สโครมาโทกราฟีจำเป็นจะต้องใช้สารมาตรฐานมาเปรียบเทียบเวลา (Retention Time) ในการระบุชนิดของสาร หรือการวิเคราะห์เชิงคุณภาพ  หากไม่มีสารมาตรฐานก็จะไม่สามารถทำการวิเคราะห์ได้  ดังนั้นการเลือกใช้ตัวตรวจวัดชนิด แมสสเปคโตรมิเตอร์ (Mass Spectrometer)  จึงได้รับความนิยมมากยิ่งขึ้นเนื่องจากไม่จำเป็นจะต้องมีสารมาตรฐานในขั้นแรกของการเริ่มวิเคราะห์เนื่องจากมีฐานข้อมูลของสารให้สามารถเปรียบเทียบได้นั่นเอง

เทคนิคแมสสเปคโตรมิเตอร์

          เป็นเทคนิคที่ใช้ในการวัด มวลต่อประจุ (m/z) ของสารประกอบ บันทึกในรูปแบบ สเปคตรัม (Spectrum) ซึ่งเทคนิคแมสสเปคโตรมิเตอร์ที่ใช้งานร่วมกับเทคนิคแก๊สโครมาโทกราฟีสามารถใช้สเปคตรัมของสารประกอบที่วิเคราะห์ได้มาเปรียบเทียบความเหมือน (Match) กับสเปคตรัมที่มีอยู่ในฐานข้อมูลเพื่อทำนายชนิดและความน่าจะเป็นของสารได้ จึงทำให้สามารถวิเคราะห์เชิงคุณภาพได้โดยไม่ต้องใช้สารมาตรฐานในการเปรียบเทียบ

รูปแสดงการเปรียบเทียบสเปคตรัมของตัวอย่างกับฐานข้อมูล

รูปแสดงผลการเปรียบเทียบกับฐานข้อมูลและความน่าจะเป็น

ส่วนประกอบของเครื่องแมสสเปคโตรมิเตอร์(ทั้งหมดทำงานภายใต้สุญญากาศ)

1. ส่วนที่ทำให้สารเกิดเป็นไอออน (Ion source)
2. ส่วนคัดแยกมวลต่อประจุ (Mass analyzer)
3. ส่วนตรวจวัดสัญญาณ (Detector)

ส่วนที่ทำให้สารเกิดเป็นไอออน (Ion source)

          สำหรับ GC-MS จะมี ion source 2 ชนิดคือ Electron Impact (EI) และ Chemical Impact (CI) โดยชนิด EI จะได้รับความนิยมมากเนื่องจากเป็นวิธีเดียวกันกับการสร้างฐานข้อมูล  ดังนั้นหากต้องการใช้ผลการวิเคราะห์เพื่อเปรียบเทียบกับฐานข้อมูลจึงจำเป็นต้องเลือกใช้ EI ในการทำให้สารแตกตัวเป็นไอออน  และในส่วน CI เป็นเป็นทำให้สารแตกตัวเป็นไอออนด้วยพลังงานที่ต่ำ (Soft ionization) เพื่อให้ได้สเปคตรัมที่ใช้ในการยืนยันมวลโมเลกุลของสารที่สนใจ นิยมใช้ร่วมกับเทคนิคการวิเคราะห์อื่นๆ เพื่อยืนยันโครงสร้างของสารที่เกิดจากการสังเคราะห์ เป็นต้น

ส่วนคัดแยกมวลต่อประจุ (Mass analyzer)

          ทั่วไปจะมี 2 ชนิดคือ ชนิดแยกชัดต่ำ (Low resolution mass spectrometer; LRMS) และ ชนิดแยกชัดสูง (High resolution mass spectrometer; HRMS) ซึ่งแตกต่างกันที่ความละเอียดในการแยกค่ามวลต่อประจุ โดยชนิด LRMS จะแยกค่ามวลต่อประจุได้เป็นจำนวนเต็ม ซึ่งเป็นน้ำหนักที่ใกล้เคียงกับน้ำหนักเชิงอะตอมของธาตุ ดังนั้นการใช้ LRMS ในการวิเคราะห์เชิงคุณภาพจึงต้องใช้การเปรียบเทียบกับฐานข้อมูล  ส่วนชนิด HRMS จะสามารถแยกค่ามวลต่อประจุได้ละเอียดถึงทศนิยมซึ่งเป็นน้ำหนักเชิงอะตอมของธาตุ ทำให้ HRMS สามารถยืนยันโครงสร้างได้ถูกต้องโดยไม่จำเป็นต้องเทียบกับฐานข้อมูล

ส่วนคัดแยกมวลต่อประจุ (Mass analyzer) ชนิดแยกชัดต่ำ (Low resolution mass spectrometer; LRMS) ได้แก่

• Single Quadrupole ส่วนในการแยกมวล (Mass Analyzer) เป็นแท่งโลหะสี่แท่งวางตามแนวเส้นทแยงมุม (Quadrupole) จำนวน 1 ชุด ทำหน้าที่คัดมวลที่ต้องการวิเคราะห์ให้สามารถผ่านไปได้จนถึงตัวตรวจวัดเพื่อขยายสัญญาณและบันทึกผล โหมดในการวิเคราะห์สามารถเลือกได้ทั้งแบบตลอดช่วงมวล (Full scan) และแบบเลือกจำเพาะเจาะจง (Selected Ion Monitoring, SIM) ได้
• Triple Quadrupole ส่วนในการแยกมวล (Mass Analyzer) เป็นแท่งโลหะสี่แท่งวางตามแนวเส้นทแยงมุม (Quadrupole) จำนวน 3 ชุด โดย Quadrupole ชุดที่ 1 และ ชุดที่ 3 ทำหน้าที่แยกประจุ ส่วน Quadrupole ชุดที่ 2 ทำหน้าที่ในการแตก fragment สารตัวอย่างอีกครั้ง เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการวิเคราะห์เชิงปริมาณ โหมดในการวิเคราะห์สามารถเลือกได้ทั้งแบบตลอดช่วงมวล (Full scan) แบบเลือกจำเพาะเจาะจง (Selected Ion Monitoring, SIM) และ MS/MS เพื่อเพิ่มความจำเพาะเจาะจงได้ (Selected Reaction Monitoring, SRM)

ส่วนคัดแยกมวลต่อประจุ (Mass analyzer) ชนิดแยกชัดสูง (High resolution mass spectrometer; HRMS) ได้แก่

• Orbitrap ส่วนในการแยกมวล (Mass Analyzer) เป็นชนิด Orbitrap ซึ่งเป็นเทคโนโลยีใหม่ล่าสุด ทำงานโดยให้ไอออนของสารตัวอย่างวิ่งรอบอิเล็กโทรดของ Orbitrap ที่มีการจ่ายกระแสไฟฟ้าและสนามแม่เหล็ก ไอออนที่มีขนาดมวลหรือประจุที่ต่างกัน จะเคลื่อนที่ด้วยความเร็วและโมเมนตัมเชิงมุมที่ต่างกัน จากนั้นจะถูกบันทึกผลในรูปแบบของ Induction Decay แล้วแก้สมการด้วย Fourier Transform เพื่อบันทึกออกมาเป็นค่ามวลต่อประจุ (อ่านเพิ่มเติมคลิก) สามารถเข้าถึงความละเอียดขนาด 120,000 FWHM (ซึ่งสามารถทำให้สูงขึ้นได้อีก ด้วยการเพิ่มของสนามแม่เหล็กและระยะเวลาของไซโคลตรอน) ทำให้สามารถแก้ไขปัญหางานวิเคราะห์ตัวอย่างที่มีตัวรบกวน โดยสามารถแยกแยะไอออนที่มีขนาดมวลแตกต่างกัน แม้ในทศนิยมตำแหน่งที่ห้าได้
• Magnetic Sector ส่วนในการแยกมวล (Mass Analyzer) ทำหน้าที่แยกมวลโดยการเร่งให้ประจุผ่านสนามไฟฟ้าและสนามแม่เหล็ก ไอออนที่มีขนาดมวลหรือประจุที่ต่างกันเมื่อผ่านสนามแม่เหล็กแล้วจะเกิดการหักเหที่แตกต่างกันทำให้สามารถแยกมวลต่อประจุได้แบบความละเอียดสูง
• Time-of-Flight ส่วนในการแยกมวล (Mass Analyzer) สามารถแยกมวลได้โดยเร่งให้ประจุเคลื่อนที่ไปตามระยะทางด้วยความต่างศักย์ไฟฟ้า ประจุที่มีมวลมาจะใช้เวลาในการเดินทางสู่ตัวตรวจวัดได้ช้ากว่า ยิ่งระยะทางจากจุดเริ่มต้นจนจึงตัวตรวจวัดยาวมากขึ้นก็จะทำให้การแยกมวลเกิดขึ้นได้ดีขึ้นเช่นเดียวกัน

LRMS vs. HRMS

          เมื่อพิจารณาหลักการทำงานของส่วนคัดแยกมวลต่อประจุ (Mass Analyzer) แต่ละชนิดอาจจะยังไม่เห็นภาพความสำคัญของ LRMS กับ HRMS ลองมาดูผลการวิเคราะห์มวลต่อประจุที่ได้เพื่อเพิ่มความเข้าใจให้มากขึ้นกันค่ะ

รูปแสดงการเปรียบเทียบผลการวิเคราะห์ระหว่าง LRMS กับ HRMS

          จากรูปจะเห็นได้ว่า LRMS แม้จะเป็นการวิเคราะห์ด้วยโหมดแบบจำเพาะเจาะจงเฉพาะไอออน (Selected Ion Monitoring, SIM) ก็ยังคงเห็นสารอื่นที่เป็นตัวรบกวนทำให้ความไวของการวิเคราะห์ไม่ดีเมื่อเทียบกับผลการวิเคราะห์ด้วย HRMS ที่สามารถกำจัดตัวรบกวนอื่นๆ ออกไปได้หมด  ดังนั้นการเลือกใช้ HRMS นอกเหนือจากได้ความไวในการวิเคราะห์ดีแล้ว  ยังสามารถช่วยลดเวลาที่ใช้ในการแยกสารผสมอีกด้วยเนื่องจาก HRMS สามารถกำจัดตัวรบกวนออกได้แม้ว่าในขั้นตอนของการแยกในระบบแก๊สโครมาโทกราฟีเกิดได้ไม่ดีก็จะไม่ส่งผลต่อการวิเคราะห์นั่นเอง

HRMS vs. HRAM

          GC Orbitrap MS เป็นระบบที่ให้ความละเอียดสูงและความถูกต้องของมวล (High Resolution Accurate Mass; HRAM) โดยการเพิ่ม Mass Resolution จะไม่สูญเสียความเข้มของสัญญาณ (Signal Intensity) ดังนั้น GC Orbitrap MS จึงเป็นเครื่องที่มีความละเอียด (Resolution) สูงมากที่สุดควบคู่กับความถูกต้องของการอ่านค่ามวล ช่วยให้การหาองค์ประกอบของสารที่สนใจได้อย่างถูกต้องมากยิ่งขึ้น  ช่วยให้สามารถทำการวิเคราะห์แบบ Full Scan สำหรับการวิเคราะห์ตัวอย่างที่มีสารโมเลกุลขนาดเล็กในช่วง 50-1000 Da ได้ อย่างมีความจำเพาะเจาะจง (Selectivity) ในการแยกมวลต่อประจุของสารที่สนใจจากตัวรบกวนที่มีมวลโมเลกุลใกล้เคียงกันได้เป็นอย่างดี (โดยทั่วไป <5 ppm)

          ตัวอย่างการวิเคราะห์ยาฆ่าแมลงคลอร์โพรแฟม (Chlorpropham) (m/z 127.01833) และ Background Matrix Ion ถูกแยกออกจากกันอย่างแม่นยำ และมวลของสาร Chlorpropham ที่ Resolving Power เท่ากับ 60K และ 120K แสดงความถูกต้อง (Accuracy) ในการวิเคราะห์ด้วย GC Orbitrap MS

          GC Orbitrap MS จึงเป็นเครื่องมือที่ออกแบบมาเพื่อรองรับการวิเคราะห์ได้ทั้งเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยสามารถวิเคราะห์ได้ทั้งสารที่สนใจ (Targeted compound) และอื่นๆ (Untargeted compound) ขยายขอบเขตการวิเคราะห์ให้ครอบคุมได้หลากหลายมากยิ่งขึ้น 

           นอกจากนี้ยังสามารถใช้ GC Orbitrap MS ในการระบุเพื่อหา Unknown Compounds ได้ ด้วยการวิเคราะห์ที่มีความถูกต้องของมวลสูง รวมถึงข้อมูลรูปแบบไอโซโทปของสารช่วยให้สามารถคาดการณ์ถึงองค์ประกอบธาตุของสารใดๆ ได้อย่างแม่นยำ จำนวนสูตรทางเคมีที่เป็นไปได้ (Hits) ของ Unknown Compound ตัวหนึ่งๆ จะถูกคำนวณจาก Spectral Data ที่มีคุณภาพจากการใช้ Resolution สูงและให้ค่า Accuracy ในระดับที่ต่ำกว่า 1 ppm จนทำให้ลดจำนวนสูตรทางเคมีที่เป็นไปได้ของสารดังกล่าวลงในระดับที่ต่ำที่สุด ดังแสดงในรูป

          ความคลาดเคลื่อนของมวล (Mass Tolerances) ที่แตกต่างกันตั้งแต่ 0.5 ppm ถึง 10 ppm ถูกนำมาใช้เพื่อคำนวณสูตรทางเคมีที่เป็นไปได้ จะพบว่าที่ 10 ppm จะคำนวณสูตรทางเคมีได้ถึง 60 Hits ในขณะที่ระดับ 3 ppm ถึงแม้จะเป็นแบบค่อนข้างต่ำ แต่ก็ยังคำนวณได้ถึง 20 Hits แต่ในระบบ GC Orbitrap MS ที่ให้ Accuracy ได้ถึงในระดับ sub-ppm จะให้จำกัดจำนวน Hits เหลือเพียงแค่ 2 เท่านั้น สูตรทางเคมีที่คำนวณได้ในระดับความถูกต้องของมวลที่ระดับ 0.3 ppm สำหรับ m/z 304.10058 นี้ คือ C12H21N2O3PS และเมื่อส่งข้อมูลไปเทียบกับฐานข้อมูลออนไลน์ของ ChemSpider แล้วสามารถระบุได้ว่าสารดังกล่าว คือ ยาฆ่าแมลง diazinon นั่นเอง นอกจากนี้ ยังสามารถยืนยันเพิ่มเติมโดยการตรวจสอบ Fragment Ions ของสารนี้กับ Spectral Libraries ที่ได้มาจาก Electron Impact (EI) ได้อีกด้วย

ข้อมูลเพิ่มเติม GC Orbitrap GC  คลิก https://bit.ly/2Ml9Gae

          สำหรับการประยุกต์ใช้ GC Orbitrap MS ในการวิเคราะห์ด้านต่างๆ นั้น สามารถติดตามต่อในตอนหน้านะคะ

ขอบคุณค่ะ