การศึกษาความสัมพันธ์ระหว่าง DNA Methylation เฉพาะตำแหน่งกับภาวะ Thrombophilia

The Association Study of Targeted DNA Methylation and Thrombophilia

ในโลกของชีววิทยาระดับโมเลกุล กลไกการควบคุมการแสดงออกของยีนเป็นเรื่องซับซ้อนและเชื่อมโยงกันอย่างแนบแน่น หนึ่งในกลไกสำคัญที่ได้รับความสนใจอย่างมากคือ DNA methylation ซึ่งเป็นการเติมหมู่เมทิล (-CH3) ลงบนเบสไซโตซีนในบริเวณ CpG dinucleotide โดยเฉพาะในพื้นที่ของยีนที่ทำหน้าที่ควบคุมการเปิด-ปิดการทำงานของยีน การเปลี่ยนแปลงรูปแบบการ methylation นี้สามารถมีผลอย่างลึกซึ้งต่อการทำงานของเซลล์และการเกิดโรคต่าง ๆ ตั้งแต่การพัฒนาของตัวอ่อนจนถึงโรคมะเร็งและโรคหลอดเลือด

ในอีกด้านหนึ่ง ภาวะ thrombophilia คือภาวะที่ร่างกายมีแนวโน้มในการเกิดลิ่มเลือดอย่างผิดปกติ ซึ่งเป็นปัญหาสำคัญทางคลินิกที่อาจทำให้เกิดลิ่มเลือดอุดตันในหลอดเลือดดำหรือหลอดเลือดแดง ส่งผลร้ายแรงต่อสุขภาพและชีวิตผู้ป่วย มักเกี่ยวข้องกับทั้งพันธุกรรมและปัจจัยแวดล้อม แต่เมื่อเร็ว ๆ นี้ นักวิจัยเริ่มค้นพบว่า epigenetics โดยเฉพาะ DNA methylation อาจมีบทบาทสำคัญในการกำหนดความเสี่ยงของโรคนี้

DNA Methylation

DNA methylation คือกระบวนการเติมหมู่เมทิล (-CH3) ไปยังตำแหน่งเบสไซโตซีน (cytosine) ที่อยู่ติดกับเบสกัวนีน (guanine) หรือ CpG dinucleotide ซึ่งโดยปกติจะพบมากในบริเวณ promoter region ของยีน การเติมหมู่นี้มักจะส่งผลให้ยีนบริเวณนั้นถูกปิดการแสดงออก (gene silencing) โดยการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างโครมาติน ทำให้ transcription factors เข้าไม่ถงดีเอ็นเอ และส่งผลต่อการผลิตโปรตีนของเซลล์

ภาพ 1 แผนภาพแสดงกระบวนการเมทิลเลชันของ DNA และผลของการเมทิลเลชัน
ที่บริเวณโปรโมเตอร์ของยีนต่อการถอดรหัสและระดับการแสดงออกของโปรตีน
ภาพโดย BioRender.com 

Thrombophilia

Thrombophilia เป็นความผิดปกติของเลือดที่ทำให้เลือดในหลอดเลือดดำและหลอดเลือดแดงมีแนวโน้มที่จะจับตัวเป็นลิ่มได้ง่ายกว่าปกติ แพทย์เรียกภาวะนี้ว่า “ภาวะเลือดแข็งตัวง่ายเกินไป” (hypercoagulable state) เพราะเลือดสามารถแข็งตัวหรือจับตัวเป็นลิ่มได้ง่ายกว่าปกติ Thrombophilia อาจเกิดจากพันธุกรรม (ถ่ายทอดทางพันธุกรรม) หรือเป็นภาวะที่เกิดขึ้นภายหลังจากปัจจัยภายนอก โดยปกติแล้ว ร่างกายจะสร้างลิ่มเลือดเมื่อมีบาดแผล เช่น จากมีดบาด เพื่อหยุดเลือดไหล และต่อมาร่างกายจะสลายลิ่มเลือดเมื่อไม่จำเป็นอีกต่อไป แต่หากคุณมี thrombophilia ร่างกายอาจสร้างลิ่มเลือดมากเกินไป หรือไม่สามารถสลายลิ่มเลือดเก่าได้ ลิ่มเลือดสามารถอุดตันหลอดเลือด ทำให้เลือดไหลไปเลี้ยงอวัยวะต่าง ๆ ไม่เพียงพอ ซึ่งอาจก่อให้เกิดโรคหลอดเลือดสมอง (stroke), หัวใจวาย หรือทำให้อวัยวะสำคัญเสียหาย

ภาพ 2 Thrombophilia
ภาพโดย Northern Heart Hospital (NHH)

ประเภทของ Thrombophilia

1. ชนิดพันธุกรรม (Genetic/Inborn) – ได้รับถ่ายทอดจากพ่อแม่ผ่านทางพันธุกรรม ยีนที่ผิดปกติจะส่งผลต่อโปรตีนที่ควบคุมการแข็งตัวของเลือด
2. ชนิดที่เกิดขึ้นภายหลัง (Acquired) – เกิดจากปัจจัยภายนอก เช่น ยา โรคประจำตัว หรือวิถีชีวิต โดย antiphospholipid syndrome เป็นรูปแบบที่พบได้บ่อยที่สุดและมีความรุนแรงมากที่สุด

 ชนิดของ Thrombophilia ทางพันธุกรรม

• Factor V Leiden: พบได้บ่อยที่สุด (1–5%) เสี่ยงต่อการเกิดลิ่มเลือดดำ (DVT) ครั้งแรก
• Prothrombin thrombophilia: พบได้บ่อยเป็นอันดับสอง (1–5%) เสี่ยงต่อ DVT, pulmonary embolism หรือแท้งบุตร
• Protein C deficiency: พบได้น้อย (<1%) หากได้รับยีนผิดปกติจากทั้งพ่อและแม่อาจถึงชีวิต
• Protein S deficiency: พบได้น้อย (<1%) ในเด็กแรกเกิดอาจเป็นอันตรายถึงชีวิต
• Protein Z deficiency: เพิ่มความเสี่ยงต่อการเกิดลิ่มเลือดและภาวะแทรกซ้อนระหว่างตั้งครรภ์
• Antithrombin deficiency: พบใน 1 ใน 500 ถึง 5,000 ราย เสี่ยงสูงต่อการเกิดลิ่มเลือด โดยกว่า 80% จะเกิดลิ่มเลือดก่อนอายุ 50 ปี

อาการของลิ่มเลือดจาก Thrombophilia
ขึ้นอยู่กับตำแหน่งที่ลิ่มเลือดเกิดขึ้น:

• สมอง: ชัก, ปวดหัวเฉียบพลัน, พูดหรือมองเห็นลำบาก, อ่อนแรงครึ่งซีก
• หัวใจ: เจ็บหน้าอก, หายใจหอบ, เหงื่อออก, คลื่นไส้
• ปอด: หายใจเร็ว, เจ็บหน้าอกขณะหายใจลึก
• ช่องท้อง: ปวดท้อง, คลื่นไส้, อาเจียน
• แขนหรือขา: บวม, เจ็บ, อุ่นผิดปกติ

สาเหตุและปัจจัยเสี่ยง

• สาเหตุอื่น ๆ เช่น antiphospholipid syndrome, โรคตับ, HIV, โรคตับอักเสบ, DIC
• ปัจจัยเสี่ยงได้แก่:
• น้ำหนักเกิน
• ตั้งครรภ์
• สูบบุหรี่
• โรคหัวใจ เบาหวาน มะเร็ง
• ขาดการเคลื่อนไหวเป็นเวลานาน
• การผ่าตัด
• ยาคุมกำเนิดที่มีเอสโตรเจน
• แท้งซ้ำโดยไม่ทราบสาเหตุ

ในบริบทของภาวะ thrombophilia การเปลี่ยนแปลง DNA methylation ในยีนที่เกี่ยวข้องกับการแข็งตัวของเลือด เช่น ยีน Factor V หรือ Protein S อาจส่งผลให้เกิดความผิดปกติของการควบคุมการแข็งตัวและการละลายลิ่มเลือด ซึ่งส่งผลต่อความเสี่ยงการเกิดลิ่มเลือดอุดตัน

เทคนิค MassARRAY

เทคนิค MassARRAY เป็นวิธีการวัดระดับ DNA methylation ที่อาศัยหลักการของการทำ bisulfite conversion ซึ่งจะเปลี่ยนไซโตซีนที่ไม่ได้ถูก methylated เป็นยูราซิล แต่ไซโตซีนที่ methylated จะไม่ถูกเปลี่ยนแปลงหลังจากนั้น DNA จะถูกทำปฎิกรินา PCR และทำ single base extension (SBE) เพื่อแยกแยะตำแหน่ง CpG ที่สนใจ

จากนั้น ใช้เครื่อง Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) ตรวจวัดน้ำหนักโมเลกุลของชิ้น DNA ซึ่งจะมีมวลแตกต่างกันขึ้นกับว่าตำแหน่งนั้น methylated หรือไม่ เทคนิคนี้จึงมีความแม่นยำสูง สามารถวัด methylation ในหลายตำแหน่งพร้อมกัน และมีความไวสูง เหมาะสำหรับการศึกษาการเปลี่ยนแปลงของ methylation ในระดับเซลล์

DNA methylation ของการเกิด Thrombophilia

เพื่อศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างระดับ DNA methylation ในตำแหน่งเป้าหมายบนเม็ดเลือดขาวกับความเสี่ยงของการเกิด thrombophilia โดยใช้เทคนิคที่มีความละเอียดสูงและแม่นยำอย่าง MassARRAY ในการวิเคราะห์ ในงานวิจัยนี้ เก็บตัวอย่างเลือดจากผู้ป่วย thrombophilia จำนวน 8 ราย และกลุ่มควบคุมที่เป็นญาติของผู้ป่วยอีก 8 ราย จากนั้นสกัด DNA และทำ bisulfite conversion เพื่อแยกแยะตำแหน่ง methylation หลังจากนั้นใช้ MassARRAY วิเคราะห์ methylation ที่ตำแหน่งเฉพาะในยีนสำคัญ เช่น F5 และ Protein S

ผลการวิเคราะห์เผยให้เห็นว่า methylation ที่ตำแหน่ง F5.24.CpG.10 มีระดับสูงในกลุ่มควบคุม และมีความสัมพันธ์เชิงลบกับ thrombophilia ในขณะที่ตำแหน่ง Protein S.44.CpG.29–33 มีระดับ methylation สูงในกลุ่มผู้ป่วยและมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับโรค นอกจากนี้ ROC curve ยังแสดงให้เห็นว่า methylation ในสองตำแหน่งนี้มีศักยภาพสูงในการทำนายความเสี่ยง thrombophilia

 ภาพ 3 ความแตกต่างของการเมทิลเลชันของ DNA ในกลุ่มควบคุมและกลุ่มผู้ป่วย thrombophilia
A: การเมทิลเลชันของ DNA ที่ตำแหน่ง F5.24.CpG.10
B: การเมทิลเลชันของ DNA ที่ตำแหน่ง Protein S.44.CpG.29–33
*P < 0.01, P < 0.05

ภาพ 4 การวิเคราะห์ ROC สำหรับตำแหน่ง DNA methylation ที่มีความสำคัญ 2 ตำแหน่ง
A: การเมทิลเลชันของ DNA ที่ตำแหน่ง F5.24.CpG.10
B: การเมทิลเลชันของ DNA ที่ตำแหน่ง Protein S.44.CpG.29–33

การเปลี่ยนแปลงของ DNA methylation ในยีนที่เกี่ยวข้องกับการแข็งตัวของเลือดสะท้อนถึงกลไกใหม่ ๆ ที่อาจอธิบายความหลากหลายของความเสี่ยง thrombophilia เทคโนโลยี MassARRAY เป็นเครื่องมือสำคัญที่ช่วยให้นักวิจัยสามารถจับความเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ได้อย่างแม่นยำและรวดเร็ว โดยการนำเทคนิคนี้มาใช้ในการวิเคราะห์ methylation จะช่วยเปิดโอกาสใหม่ ๆ ในการค้นหา biomarker สำหรับการวินิจฉัยและการดูแลรักษาผู้ป่วย thrombophilia อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้นในอนาคต

อ้างอิง

Kui, X., Feng, J., Leng, J., Sun, C., Tang, Q., & Li, H. (2024). The Association Study of Targeted DNA Methylation and Thrombophilia. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion, 1-8.