Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA) และ MassARRAY

MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) และ MassARRAY (เทคนิคที่ใช้ MALDI-TOF mass spectrometry ในการตรวจวิเคราะห์พันธุกรรม) เป็นเทคนิคทางอณูชีววิทยาที่ใช้สำหรับการวิเคราะห์ทางพันธุกรรม แต่มีวัตถุประสงค์และวิธีการที่แตกต่างกัน ดังนี้

MLPA

MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) เป็นเทคนิคที่ใช้ในการวิเคราะห์ความแตกต่างของจำนวนสำเนา (Copy Number Variation, CNV) ของ DNA โดยเฉพาะการตรวจหาการกลายพันธุ์หรือการลบ/เพิ่มของยีนที่เกี่ยวข้องกับโรคทางพันธุกรรม

ภาพ 1  การแสดงผลของเทคนิค MLPA  เราสามารถสังเกตอิเล็กโตรเฟโรแกรม (Electropherogram)
ที่ได้จากการวิเคราะห์ MLPA ซึ่งแสดงถึงการขาดหายไปของ Exon ที่ 46 (สีแดง)
ภาพโดย https://commons.wikimedia.org/wiki/File:MLPA_in_GeneMarker.jpg)

กระบวนการทำงานของ MLPA
MLPA มีขั้นตอนหลัก ๆ ดังนี้:

1. การออกแบบโพรบ (Probe Design)
   • ใช้โพรบคู่ (Probe pair) ที่มีลำดับเฉพาะสำหรับเป้าหมายของ DNA
   • แต่ละโพรบประกอบด้วยสองส่วนที่สามารถจับกับ DNA ติดกัน
   • โพรบแต่ละตัวมีส่วนซ้าย (Left probe oligonucleotide; LPO) และส่วนขวา (Right probe oligonucleotide; RPO) โดยมีลำดับสำหรับการจับกับ DNA เป้าหมาย และลำดับที่ใช้เป็นไพรเมอร์สำหรับ PCR ทั้งนี้ RPO ยังมีลำดับเสริม (stuffer sequence) เพื่อทำให้แต่ละโพรบมีความยาวเฉพาะตัว
2. การแยกสาย DNA (Denaturation)
   • ตัวอย่าง DNA ถูกทำให้แยกสายด้วยความร้อน (~95°C) เพื่อเปิดโอกาสให้โพรบสามารถจับกับสาย DNA ได้อย่างจำเพาะ
3. การจับของโพรบ (Hybridization)
   • โพรบคู่แต่ละตัวจะจับกับสาย DNA เป้าหมายที่ตำแหน่งเฉพาะ
   • หากตำแหน่งเป้าหมายมีการลบ (deletion) โพรบจะไม่สามารถจับได้
4. การเชื่อมต่อโพรบ (Ligation)
   • เมื่อโพรบทั้งสองส่วนจับกับ DNA ได้อย่างสมบูรณ์ จะมีเอนไซม์ DNA ligase ทำหน้าที่เชื่อมต่อให้เป็นชิ้นเดียว
   • หากมีการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่งจับ อาจส่งผลให้การเชื่อมต่อล้มเหลว
5. การขยายชิ้นส่วน DNA (PCR Amplification)
   • ใช้ PCR เพื่อขยายเฉพาะโพรบที่ถูกเชื่อมต่อแล้ว
   • โพรบแต่ละตัวมีความยาวต่างกัน ทำให้สามารถแยกแยะได้ในการตรวจวิเคราะห์
6. การแยกขนาดของผลิตภัณฑ์ PCR (Capillary Electrophoresis)
   • นำผลิตภัณฑ์ PCR ไปวิเคราะห์ด้วย capillary electrophoresis
   • ขนาดของแต่ละแบนด์ที่ได้สะท้อนถึงจำนวนสำเนาของ DNA เป้าหมาย
7. การวิเคราะห์ข้อมูล
   • เปรียบเทียบปริมาณสัญญาณของผลิตภัณฑ์ PCR กับตัวอย่างอ้างอิง
   • หากมีการลบ (deletion) หรือการเพิ่ม (duplication) จะเห็นความแตกต่างของสัดส่วนสัญญาณ

การนำไปใช้ของ MLPA
• ตรวจหาความผิดปกติทางพันธุกรรม เช่น Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), Spinal Muscular Atrophy (SMA)
• วิเคราะห์การแปรผันของยีนที่เกี่ยวข้องกับมะเร็ง เช่น BRCA1 และ BRCA2
• ใช้ในการวินิจฉัยโรคที่เกี่ยวข้องกับ CNV ได้อย่างรวดเร็วและแม่นยำ แม้ในตัวอย่างที่มี DNA ปริมาณน้อย

การตรวจหาการกลายพันธุ์หรือการลบ/เพิ่มของยีนที่เกี่ยวข้องกับโรคทางพันธุกรรม

MassARRAY
MassARRAY เป็นเทคโนโลยีการวิเคราะห์พันธุกรรมที่อาศัยหลักการของ mass spectrometry (การวิเคราะห์มวลสาร) โดยมีความแม่นยำสูงในการตรวจจับการกลายพันธุ์ของยีนแบบเฉพาะตำแหน่ง เช่น SNP (Single Nucleotide Polymorphism), การกลายพันธุ์แบบจุด (Point mutation) และการแปรผันอื่น ๆ ที่เกี่ยวข้องกับโรคทางพันธุกรรมหรือการตอบสนองต่อยา

ภาพ 2  การแสดกระบวนการทำงานของ MassARRAY ในการตรวจสอบ SNP
โดยเริ่มจากการทำ PCR, การขยายตำแหน่ง SNP ด้วย iPLEX Extension Reaction
และการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ด้วย MALDI-TOF Mass Spectrometry

กระบวนการทำงานของ MassARRAY
MassARRAY มีขั้นตอนหลัก ๆ ดังนี้:

1. การออกแบบไพรเมอร์ (Primer Design)
   • ออกแบบไพรเมอร์เฉพาะสำหรับบริเวณของ DNA ที่ต้องการตรวจ
   • ไพรเมอร์ถูกออกแบบให้เหมาะสมกับการวิเคราะห์ด้วย mass spectrometry โดยมีความแม่นยำสูง
   • การออกแบบต้องพิจารณาเรื่องมวลของผลิตภัณฑ์ที่ได้จากการขยายตัวของ DNA

2. การขยายชิ้นส่วน DNA (PCR Amplification)
   • ใช้ PCR ขยายเฉพาะบริเวณของ DNA ที่สนใจ
   • ผลิตภัณฑ์ PCR จะใช้เป็นแม่แบบในขั้นตอนถัดไป
   • ขั้นตอนนี้ช่วยเพิ่มปริมาณ DNA เป้าหมายให้เพียงพอต่อการวิเคราะห์

3. การกำจัดดีเอ็นเอส่วนเกิน (SAP Treatment)
   • ใช้เอนไซม์ Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) กำจัด dNTP ที่เหลืออยู่จาก PCR
   • เพื่อป้องกันการรบกวนในขั้นตอนถัดไปของการขยายปฏิกิริยา

4. การขยายสัญญาณแบบ Single Base Extension (SBE)
   • เติมนิวคลีโอไทด์เพียงตัวเดียวต่อปลายไพรเมอร์โดยอาศัยเอนไซม์
   • การเติมนิวคลีโอไทด์นี้จะขึ้นอยู่กับเบสที่แท้จริงในตำแหน่งที่สนใจ
   • แต่ละนิวคลีโอไทด์มีมวลเฉพาะ ทำให้สามารถแยกได้ด้วย mass spectrometry

5. การวิเคราะห์ด้วย MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight)
   • นำผลิตภัณฑ์จาก SBE มาวิเคราะห์ด้วย MALDI-TOF
   • เครื่องจะตรวจวัดมวลของผลิตภัณฑ์อย่างแม่นยำ
   • ผลที่ได้จะแสดงเป็นพีคตามมวลของนิวคลีโอไทด์ที่เติมเข้าไป

6. การวิเคราะห์ข้อมูล
   • ข้อมูลจาก mass spectrometry ถูกวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์เฉพาะ
   • สามารถระบุการกลายพันธุ์, SNP หรือการแปรผันอื่น ๆ ได้อย่างชัดเจน
   • ให้ข้อมูลทั้งเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณ

การนำไปใช้ของ MassARRAY
• การวิเคราะห์ SNP เพื่อศึกษาความสัมพันธ์กับโรค เช่น มะเร็ง, เบาหวาน, ความดันโลหิตสูง
• การวินิจฉัยโรคทางพันธุกรรมเฉพาะตำแหน่ง เช่น CFTR, β-thalassemia
• การทดสอบเภสัชพันธุศาสตร์ (Pharmacogenomics) เพื่อพยากรณ์การตอบสนองต่อยา
• การศึกษา population genetics และการตรวจสอบแหล่งกำเนิดทางชีวภาพ
MassARRAY เป็นเครื่องมือที่ทรงพลัง ให้ข้อมูลที่ละเอียดและแม่นยำ เหมาะกับการตรวจวิเคราะห์ในระดับสูงและการใช้ในงานวิจัยหรืองานวินิจฉัยทางคลินิก

ตารางเปรียบเทียบ MLPA กับ MassARRAY

เลือกใช้เทคนิคใดดี?

• หากต้องการ ตรวจการเปลี่ยนแปลงจำนวนสำเนาของยีน (CNVs) หรือการลบ/การเพิ่มจำนวนของยีน → MLPA เหมาะสมกว่า
• หากต้องการ ตรวจ SNPs, การกลายพันธุ์แบบจุดเดียว หรือการวิเคราะห์เมทิลเลชัน → MassARRAY เป็นตัวเลือกที่ดีกว่า