เทคนิค Real-time PCR
เทคนิค Real-time PCR (Real Time polymerase chain reaction) หรือ quantitative PCR (qPCR : quantitative real time polymerase chain reaction) เป็นเทคนิคที่ใช้ในการเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอที่ต้องการศึกษาอย่างจำเพาะและสามารถติดตามวัดปริมาณการเพิ่มจำนวนของดีเอ็นเอเป้าหมายได้ในทุกๆรอบของการเพิ่มจำนวนในขณะที่ปฏิกิริยากำลังดำเนินอยู่ ตั้งแต่เริ่มต้นจนกระทั่งสิ้นสุดปฏิกิริยา (real-time detection) โดยใช้ดีเอ็นเอต้นแบบ (Primer) 1 คู่ ร่วมกับตัวตรวจจับ (probe) ที่ถูกออกแบบเป็นสายสั้นๆ ให้มีความจำเพาะเจาะจงกับเชื้อเป้าหมายที่ต้องการตรวจ สำหรับ probe จะมีการติดสี Fluorescence เทคนิคนี้อาศัยการตรวจวัดสัญญาณสารเรืองแสงที่ถูกปล่อยออกมา ปริมาณแสงที่วัดได้จะเป็นสัดส่วนโดยตรงกับปริมาณดีเอ็นเอที่เพิ่มขึ้นจากปฏิกิริยาในแต่ละรอบ
โดยทั่วไปดีเอ็นเอที่เพิ่มจากการทำปฏิกิริยา PCR จะเพิ่มเป็นลักษณะกราฟรูปตัว S (sigmoid หรือ exponential curve) โดยแกน Y แสดงสัญญาณการเรืองแสง และแกน X แสดงจำนวนรอบของการเพิ่มจำนวน การทำ real-time PCR เพื่อที่จะให้ได้ข้อมูลที่ถูกต้องแม่นยำ การตรวจวัดผลผลิต PCR ในเวลาที่เกิดขึ้นจะทำเฉพาะในช่วง exponential phase ซึ่งเป็นช่วงที่ระดับสัญญาณสารเรืองแสงสูงเหนือระดับ threshold และมีแนวโน้มการเพิ่มจำนวนแบบทวีคูณ (exponential) เท่านั้น
รูปแสดง กราฟการเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอด้วยเทคนิค real-time PCR
รูปแบบการตรวจวัดสำหรับเทคนิค real-time PCR
การตรวจวัดปริมาณการเพิ่มจำนวนของดีเอ็นเอด้วยสารเรืองแสงในเทคนิค real-time PCR สามารถแบ่งได้เป็น 2 ชนิดใหญ่ ๆ ดังนี้
- DNA binding fluorescent dyes
การตรวจวัดปริมาณสายดีเอ็นเอที่สร้างขึ้นใหม่โดยใช้สารฟลูออเรสเซนซ์ที่สามารถจับกับดีเอ็นเอสายคู่ได้ (DNA binding fluorescent dyes) โดยทั่วไปที่นิยมใช้ คือ SYBR Green I
- Probe-based assay
การตรวจวัดปริมาณสายดีเอ็นเอที่สร้างขึ้นใหม่โดยใช้โพรบ (probe) ที่กำหนดติด label โดยจะแบ่งเป็น 2 ประเภทใหญ่ๆ ดังนี้
2.1 Hydrolysis Probe ตัวอย่างเช่น TaqMan probe, Molecular Beacons, FRET และ Scorpion probe
2.2 Hybridization Probes ตัวอย่างเช่น Light Cycler
อ้างอิง
1.https://meded.psu.ac.th/binlaApp/class02/B2_364_221/Molecular_genetic_part2/index7.html
2. https://www4.fisheries.go.th/local/file_document/20191225105459_1_file.pdf
3. https://www.slideshare.net/panothai/original-basic-realtimepcr