การค้นหาเครื่องหมายโมเลกุล SNP ทั้งจีโนมด้วยเทคนิค Genotyping-by-Sequencing (GBS)

 

Genotyping-by-Sequencing (GBS) คือเทคนิคที่ใช้ในการค้นหาเครื่องหมายโมเลกุลสนิป (single nucleotide polymorphism, SNP) ซึ่งเป็นกระบวนการค้นหา SNP แบบทั่วทั้งจีโนม (genome-wide SNP discovery) ด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ (restriction enzyme) ร่วมกับการใช้เทคโนโลยี Next Generation Sequencing (NGS) ในการหาลำดับเบส เทคนิค GBS สามารถค้นหาและจีโนไทป์สนิปได้ในขั้นตอนเดียว ซึ่งสามารถค้นหาสนิปได้มากถึง 50,000- 100,000 ตำแหน่งจากจีโนม จึงสามารถนำมาประยุกต์ใช้กับสิ่งมีชีวิตได้ทุกสปีชีย์ รวมถึงสิ่งมีชีวิตที่ยังไม่มีข้อมูลทางจีโนมิกส์ การค้นหาเครื่องหมายโมเลกุลในรูปแบบของ SNP ด้วยเทคโนโลยี GBS จึงช่วยประหยัดเวลาและค่าใช้จ่ายได้อย่างมากเมื่อเทียบกับการหาลับดับเบสทั้งจีโนม (Whole genome sequencing) นอกจากนี้เทคนิค GBS ยังมีประโยชน์อย่างยิ่งในการพัฒนาสนิปสำหรับใช้เป็นเครื่องหมายโมเลกุล (DNA marker) เพื่อใช้เป็นเครื่องหมายโมเลกุลมาใช้ในการคัดเลือกสายพันธุ์ (Marker-Assisted Selection หรือ MAS) การปรับปรุงพันธุ์ อีกทั้งยังสามารถใช้โมเลกุลเครื่องหมายเพื่อตรวจเอกลักษณ์ของสายพันธุ์ ตรวจสอบสายพันธุ์ลูกผสม  การจัดจำแนกพันธุ์สิ่งมีชีวิตที่มีฐานพันธุกรรมใกล้เคียงกัน นอกจากนี้ยังสามารถนำข้อมูล GBS มาร่วมวิเคราะห์เพื่อศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างลำดับเบสต่อลักษณะปรากฎ (Genome-wide association study หรือ GWAS) ได้ 

 ขั้นตอนการค้นหาเครื่องหมายโมเลกุลในรูปแบบของ SNP ด้วย GBS (Genotyping by Sequencing)

  1. DNA purification คือการเตรียมดีเอ็นเอจากตัวอย่างสิ่งมีชีวิตที่ต้องการศึกษา
  2. DNA shearing/ DNA fragmentation คือการย่อยดีเอ็นเอด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ (Restriction enzyme) ด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ 1 ชนิด หรือร่วมกัน 2 ชนิด ที่เรียกว่า double digestion  
  3. DNA fragment library preparation คือการเตรียมดีเอ็นเอต้นแบบ (DNA Library) ด้วยการคัดเลือกสายดีเอ็นเอที่ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะแล้ว ตามขนาดที่ต้องการ (ประมาณ 200-300 เบส) ต่อปลายของชิ้นส่วนดีเอ็นเอทั้ง 2 ด้านด้วย Adapter 2 ชนิด ซึ่งถูกออกแบบให้เข้าคู่กับส่วนปลายของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ
  4. PCR amplification อาศัยหลักการ Sequencing by Synthesis (SBS) โดยใช้ DNA polymerase ในการสังเคราะห์สายดีเอ็นเอจากดีเอ็นเอต้นแบบสายเดี่ยวให้เป็นดีเอ็นเอสายคู่
  5. Instrument loading/ DNA sequencing คือ การหาลำดับนิวคลีโอไทด์ด้วยเครื่องวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ยุคใหม่ (illumina platform) โดยนำอนุภาคที่มีการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอมาใส่ลงบนแผ่นไมโครชิพ (Microchip) ที่สามารถหาลำดับนิวคลีโอไทด์ได้จำนวน 60-80 ล้านตำแหน่ง (read) ซึ่งแต่ละหลุมบนไมโครชิพนี้สามารถบรรจุได้เพียงอนุภาคเดียวฉะนั้นหนึ่งอนุภาคจึงเทียบได้ กับหนึ่งตำแหน่งข้อมูล จากนั้นเครื่องจะเติม Deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) เข้าไปทีละชนิดซึ่งนิวคลีโอไทด์ที่เข้าคู่กับสายดีเอ็นเอต้นแบบเท่านั้นจึงจะเกิดการสังเคราะห์ และเครื่องตรวจวัดความเปลี่ยนแปลงของลำดับเบสจากการเข้าคู่และเกิดปฏิกิริยาสังเคราะห์ดีเอ็นเอ
  6. Bioinformatic analysis คือการอ่านผลลำดับเบส วิเคราะห์ และค้นหาตำแหน่ง SNP โดยการเปรียบเทียบลำดับเบสในกันกลุ่มประชากรและเปรียบเทียบกับลำดับเบสดีเอ็นเอต้นแบบ (ถ้ามี)

 

  ภาพที่1 แสดงขั้นตอนการค้นหาเครื่องหมายโมเลกุลในรูปแบบของ SNP ด้วยเทคนิค GBS (Genotyping by Sequencing)

   

 ภาพที่ 2 แสดงลักษณะการค้นหาเครื่องหมายโมเลกุลสนิป (single nucleotide polymorphism, SNP) แบบทั่วทั้งจีโนม (genome-wide SNP discovery) ด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ (restriction enzyme) ร่วมกับการใช้เทคโนโลยี Next Generation Sequencing (NGS) (Keygene et al., 2012)

 การค้นหาเครื่องหมายโมเลกุลในรูปแบบของ SNP ด้วยเทคนิค GBS (Genotyping by Sequencing) ของบริษัท LGC Biosearch

  • สามารถค้นพบ SNPs ในสิ่งมีชีวิตที่ต้องการศึกษา โดยไม่ต้องอาศัยข้อมูลของ Genome sequence
  • ประหยัดค่าใช้จ่ายเมื่อเทียบกับการค้นหา SNP แบบทั่วทั้งจีโนม (genome-wide SNP discovery)
  • ได้ข้อมูล SNP จำนวนมากในแต่ละตัวอย่าง สามารถข้อมูลมาใช้วิเคราะห์ได้หลากหลายรูปแบบ
  • ปฎิบัติการในห้องปฎิบัติการที่ได้มาตรฐาน มีความเชี่ยวชาญ และรวดเร็ว อีกทั้งยังใช้เทคนิควิเคราะห์ข้อมูลที่ได้ลิขสิทธิ์เฉพาะของทาง LGC
  • รองรับการบริการค้นหา หรือออกแบบไพรเมอร์สำหรับงาน high-throughput KASP genotyping โดยประยุกต์ใช้ข้อมูลเครื่องหมายโมเลกุลในรูปแบบของ SNP ในงานคัดเลือกสายพันธุ์ หรือตรวจสอบสายพันธุ์
  • บริการวิเคราะห์ข้อมูลเครื่องหมายโมเลกุลในรูปแบบของ SNP ด้วยเทคโนโลยี GBS ซึ่งประกอบด้วย sequence pre-processing การทำการเปรียบเทียบข้อมูลลำดับเบส (alignment) และการวิเคราะห์ที่หลากหลาย

 การประยุกต์ใช้การค้นหาเครื่องหมายโมเลกุลในรูปแบบของ SNP ด้วยเทคนิค GBS

ประกอบด้วย

  • Co-dominant SNP Genotyping
  • Genetic Diversity Analysis
  • Genetic Mapping
  • QTL Mapping
  • Bulk Segregant Analysis
  • Mapping to Whole Genome Sequence
  • Discovery of (rare) SNP variants
  • Genome Wide Association Mapping
  • Genomic Selection/Prediction

 เอกสารอ้างอิง

Keygene N.V. owns patents and patent applications protecting its sequence based genotyping technologies, as described by Truong et al., PLoS ONE 7: e37565, 2012 . LGC          has a licence from KeyGene N.V. to offer the GBS service for any organisms provided that use and application in human and animal shall be limited to research use only.

https://biosearch-cdn.azureedge.net/assetsv6/efficient-high-throughput-snp-discovery-genotyping-ngbs-app-note.pdf

https://www.biosearchtech.com/services/sequencing/genotyping-by-sequencing-gbs

ติดต่อเพื่อขอข้อมูลเพิ่มเติมได้ที่:

http://www.lifomics.com/contact.html

Line: @lifomics

https://www.biosearchtech.com/services/sequencing/genotyping-by-sequencing-gbs#?tab=page_7538

 

 

 

Monthathip Thongkum