เทคโนโลยีการตรวจวิเคราะห์สารพันธุกรรมชั้นสูง (MassARRAY Technology)

 

 

MassARRAY Technology

 

                 ในปัจจุบันเทคโนโลยีของการวิเคราะห์ในระดับอณูชีววิทยาได้มีการพัฒนาอย่างก้าวหน้าด้วยความรวดเร็ว โดยเฉพาะงานวิจัยเพื่อหาคำตอบในระดับ DNA และยีนส์ที่เกี่ยวข้องกับโรคทางพันธุกรรมชนิดต่างๆ มีเครื่องมือวิเคราะห์พิเศษ ที่เรียกว่า Next Generation Sequencing (NGS) ซึ่งเป็นเทคโนโลยีที่ใช้ในการหาข้อมูลภาพรวมของแผนผังระดับยีนส์และจีโนม (Genetic & Genomic Profiling)

                 สภาวะการณ์ของประเทศไทยในปัจจุบันมีหลากหลายสถาบันการศึกษานำเครื่องมือดังกล่าวเข้ามาใช้บ้างแล้ว แต่ข้อจำกัดของเทคโนโลยี NGS สองประการ กล่าวคือ ปัญหาเรื่องการให้ข้อมูลในช่วงกว้างอย่างไม่เฉพาะเจาะจง (Wide Range Information Generating) ทำให้เกิดภาวะคอขวดของการแปลผลข้อมูล (Bioinformatic Burden) อีกทั้งกระบวนการในการแปลผลใช้เวลานาน (Slow Turn Around Time) ทำให้เป็นข้อจำกัดในการนำมาประยุกต์ใช้ ซึ่งต้องการไม่เฉพาะข้อมูลที่แม่นยำอีกทั้งต้องยังต้องแข่งกับเวลาอีกด้วย จึงจำเป็นต้องอาศัยเทคโนโลยีอื่นที่จะมาช่วยเสริมจุดอ่อนของ NGS นั่นก็คือ เทคโนโลยี MassARRAY

 

หลักการทำงานของ MassARRAY

                 MassARRAY เป็นเทคนิคที่ใช้สำหรับในการตรวจวิเคราะห์สารพันธุกรรม ทั้งดีเอ็นเอ (DNA) และอาร์เอ็นเอ (RNA) ด้วยวิธี Multiplex PCR ร่วมกับ MALDI-TOF Mass Spectrometry โดยใช้หลักการของการตรวจวิเคราะห์วัดน้ำหนักมวลโมเลกุลของสารพันธุกรรม ซึ่งโดยธรรมชาติที่ว่าสารพันธุกรรมใดๆจะประกอบด้วยเบสพื้นฐาน 4 ตัว คือ Adenine, Cytosine, Guanine และ Thymine (A, C, G และ T) ซึ่งแต่ละชนิดเบสจะมีน้ำหนักมวลโมเลกุลที่แตกต่างกันอันเป็นเอกลักษณ์เฉพาะของแต่ละเบสดังนั้น สารพันธุกรรมที่เราจะนำมาตรวจวิเคราะห์ แต่ละชนิดจึงมีขนาดน้ำหนักมวลโมเลกุลแตกต่างกันด้วย ขึ้นอยู่กับชนิดของเบสตรงตำแหน่งเป้าหมายที่ต้องการ ( เช่น SNP site หรือ Variant site เป็นต้น ) ลำดับเบสและความยาวหรือจำนวนของเบสบนสายโพลีนิวคลีโอไทด์

                 หลักการทำงานสำคัญของ MassARRAY คือ สกัด DNA จากตัวอย่าง นำ DNA ที่สกัดแล้วในรูปแบบ PCR Product นำเข้าสู่ เครื่อง MassARRAY ซึ่งจะใช้ปฏิกริยา multiplex PCR ผสมผสานกับเทคโนโลยีชั้นสูงของ SpectroChip เพื่อทำ MassSpectrometry (สารที่น้ำหนักน้อยจะวิ่งได้เร็วกว่าสารที่มีน้ำหนักมาก) จึงมีความแตกต่างของ “เวลา” ของสารที่ต่างน้ำหนักกัน ทำให้แยกสารตัวอย่างที่ต้องการหาออกมาเป็น Peak ที่เห็นได้ชัดเจน โดยการร่วมประมวลผลด้วยซอฟท์แวร์พิเศษ การใช้ MassARRAY ในการวิเคราะห์สารที่รู้ลำดับเบสแน่นอน (Known Target) จึงมีความแม่นยำถูกต้องในระดับ 99.7%

 

 

องค์ประกอบของ MassARRAY

                 MassARRAY Analyzer 4 Systems เครื่องตรวจวิเคราะห์น้ำหนักมวลโมเลกุลด้วย MALDI-TOF Mass Spectrometry มี 2 ขนาด คือ 96-well และ 384-well ประกอบด้วย SpectroCHIP ที่ใส่ตัวอย่างสำหรับเข้าเครื่องตรวจวิเคราะห์ MassARRAY และ Software ชุดโปรแกรมสำหรับการประมวลผลและรายงานผลซึ่งมีให้เลือกอยู่ 2 ชุดโปรแกรม ได้แก่ Typer software สำหรับ genotyping หรือ mutation analysis และ Epityper software สำหรับ DNA methylation การตรวจวิเคราะห์ Genotyping และ Mutation Analysis MassARRAY สามารถตรวจวิเคราะห์ได้ถึง 40 ตำแหน่ง (markers) ในปฏิกิริยาเดียวกัน และสามารถตรวจวิเคราะห์ตัวอย่างที่เป็น Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) ได้

ขั้นตอนการทำงานประกอบด้วย 2 องค์ประกอบหลัก

  1. การทำ Multiplex PCR ประกอบด้วย 3 ขั้นตอน ได้แก่
    • PCR Amplification คือ ขั้นตอนการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม โดยอาศัยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) ด้วยชุดไพรเมอร์ที่ประกอบด้วย forward primers และ reverse primers ของตำแหน่งเป้าหมาย (target DNAs)
    • Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) Treatment คือ ขั้นตอนการกำจัด dNTPs ส่วนเกินที่เหลือจากการทำ PCR Amplification ในขั้นตอนแรก
    • Single Base Extension (SBE) คือ ขั้นตอนปฏิกิริยาการต่อนิวคลีโอไทด์เบสที่มีคุณสมบัติเป็น terminator nucleotides (ddNTPs) จำนวน 1 เบสเข้าไปยังฝั่ง 3’ ของสาย extension primers ที่ออกแบบมาจำเพาะให้อยู่ชิดกับตำแหน่งเป้าหมาย เพื่อให้ terminator nucleotides ซึ่งมีคุณลักษณะเป็นเบสคู่สมกับตำแหน่งเป้าหมายมาต่อ จากนั้นจึงหยุดการต่อสายทันที เกิดผลิตภัณฑ์ขึ้นเรียกว่า extension products หลังจากนั้นจึงนำ extension products เข้าสู่ กระบวนการตรวจวิเคราะห์ด้วย Mass Spectrometry ต่อไป

       2. การทำ MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis เป็นการตรวจวิเคราะห์วัดน้ำหนักมวลโมเลกุลของ extension products ซึ่งมีน้ำหนักมวลโมเลกุลแตกต่างกันขึ้นอยู่กับชนิดของสารพันธุกรรมและ nucleotide base ตรงตำแหน่ง variant ที่เกิดขึ้น

 

Patiya Prasertsilp